基于病毒的生物制品生产中的切向流过滤应用

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来自加拿大麦吉尔大学等的科学家们在2019年第37的《Vaccine》杂志上发表了题为“Production of rVSV-ZEBOV in serum-free suspension culture of HEK293SF cells”的文章。文中，研究人员指出埃博拉病毒疾病目前仍是一种为国际社会关切的重点疾病，已有多篇文章报导了数种疫苗首选物在非人体灵长类动物研究以及临床试验中的积极结果，而其中最有前景的是rVSV-ZEBOV疫苗（基于重组水泡口炎病毒的埃博拉病毒Zaire株疫苗）。在此研究中，研究人员尝试使用悬浮的HEK 293SF细胞和无血清培养基生产rVSV-ZEBOV，其目的是使用HEK 293SF生产平台，建议工艺，优化生产滴度，证实生产的可放大性以及所获得物料在动物模型中诱导免疫反应的有效性。

文中，生产和纯化用于动物研究的rVSV-ZEBOV物料时，以2L摇瓶培养HEK 293SF细胞，工作体积600mL，培养至细胞密度1.88 x 10^6cells/mL，以MOI 0.01感染，感染后48小时收获培养液，加入10 U/mL Benzonase孵育，消解DNA和RNA。离心收获含有rVSV-ZEBOV的上清液，使用63mm玻璃纤维预过滤器和0.45μm过滤器两步过滤。滤液使用配有MWCO 750 kD 中空纤维组件的KrosFlo® Research 2i 切向流过滤系统浓缩40倍，浓缩的病毒再以碘克沙醇密度梯度离心纯化，并以由10mM Tris组成并补充4%蔗糖的注射缓冲液洗滤7体积。样品进一步浓缩至3.5mL，然后加入人血清白蛋白至终浓度2.5 g/L，以确保冻存时，注射缓冲液中的纯化病毒的稳定性。

原文：J.Gelinas, H.Azizi, S.Kiesslich, et al., Production of rVSV-ZEBOV in serum-free suspension culture of HEK 293SF cells. Vaccine, 2019, 37: 6624-6632.

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来自美国堪萨斯大学的科学家们在2019年第37期的《Vaccine》杂志上发表了题为“Stabilization and formulation of a recombinant Human Cytomegalovirus vector for use as acandidate HIV-1 vaccine”的文章。文中，研究人员指出减毒活疫苗/载体候选物天然较不稳定，如果没有明确的合适制剂、储存条件和临床操作方法，感染性滴度很有可能损失。在基于重组人体巨细胞病毒载体（rHCMV-1）的HIV-1候选疫苗的初步工艺开发中，在于4℃储存并冻融后，可观察到较大的载体滴度损失。所以，原文研究的目的是针对早期临床试验中的潜在使用，开发rHCMV-1的候选冻存液体制剂，以优化冻融和短期液体稳定性。

为此，研究人员开发了一种病毒稳定性筛选程序，包括使用一种基于细胞的快速、体外免疫荧光聚焦方法，以定量病毒滴度。实验评估了包括~50种赋形剂的数据库，以确定其对冻融循环或持续数天的4℃孵育后病毒载体稳定的影响。特定的添加剂包括糖和聚合物以及去除NaCl，以保护rHCMV-1避免冻融导致的病毒滴度损失。优化的溶液条件降低了rHCMV-1在4℃液体状态中的损失速率。评估了多种赋形剂组合后，设计了三种新的候选剂型。从降低rHCMV-1在5次冻融循环或30天4℃孵育后滴度损失来看，新候选剂型的稳定性显著提升。新剂型的开发有助于更快地开展早期临床试验。

文中，在生产rHCMV-1时，病毒感染于细胞工厂中培养的DAXX-siRNA转染的MRC-5细胞，感染后12天，进行第二次DAXX-siRNA转染，置换培养基。达到完整细胞病变效应（CPE）后，收获上清液，离心澄清去除较大的细胞碎片，然后再以超滤和洗滤纯化。澄清的病毒上清液先浓缩20倍，使用膜表面积1000cm2、孔径50nm、内径0.5mm的聚砜材质MiniKros®中空纤维组件，之后再以切向流过滤方式立即换液12.5体积的TNS缓冲液，两步操作中剪切均为2400S-1，平均TMP维持为1.5psi。鉴定物料的无菌性、遗传一致性以及抗原表达。病毒储存于-80℃，以做后续试验准备。

原文：O.S.Kumru, S. Saleh-Birdjanis, L.R.Antunez, et al., Stabilization and formulation of a recombinant Human Cytomegalovirus vector for use as acandidate HIV-1 vaccine. Vaccine, 2019, 37: 6696-6706.

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来自美国维克森林大学和安徽师范大学的科学家们在2019年的《Nucleic Acids Research》杂志上发表了题为“Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing”的文章。文中，研究人员指出CRISPR/Cas9机制的瞬时表达不仅可降低脱靶导致的突变风险，还可降低针对Cas9蛋白质的潜在免疫反应，而其新近开发的系统通过适体和适体结合蛋白（ABP）之间的特定相互作用，可在单个慢病毒样颗粒（Lentivirus-Like Particle, LVLP）中包装达100个Cas9 mRNA 拷贝，基于此，研究人员开发了一种基于慢病毒衣壳的生物纳米颗粒系统，其可高效包装Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）。结果显示，用一个com 适体替代sgRNA支架的四聚体，可保留向导RNA的功能，com-修饰的sgRNA可通过ABP和适体以及sgRNA和Cas9蛋白质之间的特定相互作用，将Cas9/sgRNA RNP包装进慢病毒样颗粒。这些RNP生物纳米颗粒可在不同细胞中的不同靶点上产生插入和缺失，其效率与研究人员此前报道的Cas9 mRNA LVLP相当或更好。新系统反应快速，可降低脱靶率，使其在递送Cas9 RNP用于瞬时Cas9表达和有效基因编辑时更方便、高效。

实验中，研究人员使用HEK 293T细胞培养生产Cas9 RNP LVLP。培养结束后，使用KrosFlo ® Research 2i 切向流过滤系统，以浓缩-洗滤-浓缩模式浓缩含有LVLP的上清液，简单来说，150-300mL 上清液先浓缩至~50mL，以500-1000mL PBS洗滤，最后浓缩至~8mL。中空纤维组件材质为mPES（改性聚醚砜），MWCO为500kD。D02-E500-05-N组件的流速和压力维持为80ml/min和8psi，C02-E500-05-N的流速和压力维持为10ml/min和5psi。

原文：P.Lyu, P.Javidi-Parsijani, A.Atala, et al., Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research, 2019, doi:10.1093/nar/gkz605.

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

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